導讀：選取4種從石油污染土壤中分離出的石油降解菌包括根瘤菌、節細菌、嗜鹽菌和芽孢桿菌，對模擬石油污染土壤進行了微生物修復實驗。考察了4種菌單獨使用時的石油降解率，確定了混合菌的最佳配比和菌群的最優培養。條件，并對比了微生物修復前后土壤的各項性質。
石油及其制品在生產、加工、運輸和使用過程中產生的大量石油污染物進入環境，對土壤造成了嚴重污染，因此對石油污染土壤的治理已迫在眉睫。石油污染土壤治理技術中，與物理修復、化學修復技術相比，微生物修復技術因其修復效果好、操作簡便、費用低、降解過程迅速和無二次污染等特點，被廣泛采用。微生物修復技術的本質是通過微生物的代謝活動將污染物降解，修復過程所用的微生物多為土著微生物；若要提高修復效果，還需引入馴化的高效石油降解菌。
相比于正交設計，均勻設計的主要優勢是：在因素和水平數均較多的情況下，用較少的實驗次數就可獲得期望的結果，節省人力和物力，便于實施。目前，國內還少見將均勻設計法用于石油污染土壤微生物修復技術的研究報道。本工作采用從東營石油污染土壤中富集、分離出的4種高效石油降解菌，對模擬石油污染土壤進行微生物修復。在單菌種使用效果不理想的情況下，研究了多種高效石油降解菌混合使用的效果，確定了各菌的最佳配比及菌群的最優培養條件，并進一步從理化性質、酶活性和微生物種群數量方面比較了土壤經微生物修復前后的變化，為東營石油污染土壤微生物修復的現場應用提供了技術參考和理論支持。
1、實驗部分
1.1材料、試劑和儀器
原油：山東省東營市某煉油廠；土壤：山東省東營市東營未受污染的淺層（5~25cm）土壤。土壤經破碎、除雜、混勻、篩分后，按原油與土壤質量比為1∶20混合均勻，制成模擬石油污染土壤（模擬土樣），并將其密封儲存在滅菌牛皮紙袋內冷藏備用。
LB培養基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂15g/L；菌種（包括根瘤菌（A）、節細菌（B）、嗜鹽菌（C）和芽孢桿菌（D））：實驗室保藏；表面活性劑：主要成分為槐糖脂。
PHS-3型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；
721型可見光分光光度計：北京光學儀器廠。
1.2實驗方法
1.2.14種單菌與土著微生物石油降解率的比較
采用LB培養基保藏4種單菌。將模擬土樣按每份50g分別裝入80個錐形瓶中，并將錐形瓶分成5組，每組16個。取其中4組分別以50.0mL/kg的接種量加入A，B，C，D菌懸液，置于28℃恒溫箱中。剩余1組未加菌種，作為對照樣考察土著微生物的修復作用。每間隔一段時間取樣，采用重量法測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率。
1.2.2優勢菌群的構建和最佳配比的確定
對4種菌進行2種、3種、4種的組合，分別將不同組合的混合菌按一定的接種量加入到模擬土樣中，每組加入的混合菌菌懸液的總接種量均為50.0mL/kg，各加入菌的接種量分別相等。在28℃的恒溫箱中放置40d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率，從而構建出優勢菌群。采用均勻設計法對優勢菌群的配比進行優化。
1.2.3培養條件優化實驗選取
5個影響石油降解率的代表性因素：混合菌接種量、土壤含水率、雞糞加入量、麥糠加入量和表面活性劑加入量，并將其控制在不同水平，采取均勻設計考察各因素對修復效果的影響。按確定的最佳配比將4種菌接種到石油污染土壤中，在28℃的恒溫箱中放置40d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率。
1.3分析方法
1.3.1土壤理化性質測定方法
采用電位法測定土樣pH，水與土的體積比為2.5；重鉻酸鉀容量法測定模擬土樣的有機質含量；半微量凱氏法測定模擬土樣的總氮含量；鉬銻抗比色法測定模擬土樣的總磷含量。
1.3.2土壤酶活性及微生物種群數量的測定
采用TTC法測定模擬土樣中脫氫酶的活性，奈氏比色法測定脲酶的活性，鄰苯三酚比色法測定多酚氧化酶的活性，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶的活性；采用菌落形成單位CFU計數測定土壤的微生物種群數量。
2、結果與討論
2.14種單菌與土著微生物對石油降解率的影響
4種單菌與土著微生物對石油降解率的影響見圖1。由圖可見：使用4種單菌時石油降解率的高低順序為D>C>A>B，且均高于土著微生物；D菌處理40d后，石油降解率達30.08%，而土著微生物處理40d培養后的石油降解率僅為5.02%。
2.2優勢菌群的構建和最佳配比的確定
混合菌的配比對石油降解率的影響見表1。由表1可見，當A，B，C，D4種菌混合使用時，石油降解率最高，達到40.02%。
采用U11（114）均勻設計表進行實驗，確定A，B，C，D4種菌的最佳配比。U11（114）均勻設計的實驗方案和結果見表2，其中：X1為A的質量分數，X2為B的質量分數，X3為C的質量分數，X4為D的質量分數。
U11（114）均勻實驗的數據處理采用UniformDesign2.10軟件，得出回歸方程見式（1）。
方差分析表中顯著性水平為0.009<0.01，回歸方程變量間關系是極顯著的。混合菌的最佳配比為：X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%，預測最高石油降解率為54.30%。在最佳配比條件下進行驗證實驗，石油降解率為54.50%，與預測結果的誤差為0.37%。實驗值與預測值的誤差在允許范圍之內，說明均勻設計優化的菌種配比準確可信。
2.3培養條件優化實驗
采用U14（148）均勻設計表進行實驗，研究各培養條件對石油降解率的影響。U14（148）均勻設計的實驗方案和結果見表3。其中：U1為混合菌接種量，U2為土壤含水率，U3為雞糞加入量，U4為麥糠加入量，U5為表面活性劑加入量。
U14（148）均勻實驗數據的處理采用UniformDesign2.10軟件，得出回歸方程見式（2）。
方差分析表中顯著性水平為0.001<0.01，回歸方程變量間關系是極顯著的。菌群的最優培養條件為：混合菌接種量122.0mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90g/kg、麥糠加入量150g/kg和表面活性劑加入量22mL/kg，預測最高石油降解率為67.35%。在最優培養條件下進行驗證實驗，石油降解率為66.95%，與預測結果的誤差為0.59%。實驗值與預測值的誤差在允許范圍之內，說明均勻設計優化的菌群培養條件準確可信。
2.4微生物修復前后土壤性質的對比
分別將未經處理的模擬土樣、經土著微生物通風堆肥法處理的模擬土樣、經混合菌處理（最佳配比及最優培養條件下）的模擬土樣記作M1，M2，M3，考察微生物修復前后土壤理化性質、酶活性和微生物種群數量的變化。經過不同處理的模擬土樣的性質見表4。
由表4可見，M3的修復效果最好，石油降解率達66.95%，而M2的石油降解率僅為5.02%。由于M3在修復過程中投入了大量的營養物質，因此土樣中有機質和總氮含量大幅提高；而M2的各指標變化則不如M3的明顯。M3中脫氫酶和過氧化氫酶活性最高，這是由于在修復過程中土壤微生物大量繁殖，微生物參與了石油烴的降解過程，使得脫氫酶和過氧化氫酶活性提高。M3中的脲酶活性最高，說明土壤的氮元素轉化能力強，有利于土壤中微生物的生長，為微生物參與石油烴的降解提供了充足的營養條件。而M2中各種酶活性的變化均不如M3中明顯。M3在細菌、放線菌和真菌的數量方面均明顯高于M1和M2，接近于自然界中實際的微生物數量。
3、結論
a）實驗室保藏的A，B，C，D4種高效石油降解菌均可提高微生物修復石油污染土壤的效果。單菌在40d修復過程中的修復效果遠遠超出土著微生物，且4種單菌石油降解率的高低順序為：D>C>A>B。
b）4種菌混合除油的效果最好，在最佳配比（X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%）條件下，40d后土壤的石油降解率達54.50%。
c）菌群的最優培養條件為：混合菌接種量122.0mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90g/kg、麥糠加入量150g/kg和表面活性劑加入量22mL/kg；在此條件下，40d后土壤的石油降解率達66.95%。
d）經混合菌修復的石油污染土壤，其肥力明顯升高，脫氫酶、過氧化酶和脲酶的活性均升高，微生物數量也有明顯增加。
石油及其制品在生產、加工、運輸和使用過程中產生的大量石油污染物進入環境，對土壤造成了嚴重污染，因此對石油污染土壤的治理已迫在眉睫。石油污染土壤治理技術中，與物理修復、化學修復技術相比，微生物修復技術因其修復效果好、操作簡便、費用低、降解過程迅速和無二次污染等特點，被廣泛采用。微生物修復技術的本質是通過微生物的代謝活動將污染物降解，修復過程所用的微生物多為土著微生物；若要提高修復效果，還需引入馴化的高效石油降解菌。
相比于正交設計，均勻設計的主要優勢是：在因素和水平數均較多的情況下，用較少的實驗次數就可獲得期望的結果，節省人力和物力，便于實施。目前，國內還少見將均勻設計法用于石油污染土壤微生物修復技術的研究報道。本工作采用從東營石油污染土壤中富集、分離出的4種高效石油降解菌，對模擬石油污染土壤進行微生物修復。在單菌種使用效果不理想的情況下，研究了多種高效石油降解菌混合使用的效果，確定了各菌的最佳配比及菌群的最優培養條件，并進一步從理化性質、酶活性和微生物種群數量方面比較了土壤經微生物修復前后的變化，為東營石油污染土壤微生物修復的現場應用提供了技術參考和理論支持。
1、實驗部分
1.1材料、試劑和儀器
原油：山東省東營市某煉油廠；土壤：山東省東營市東營未受污染的淺層（5~25cm）土壤。土壤經破碎、除雜、混勻、篩分后，按原油與土壤質量比為1∶20混合均勻，制成模擬石油污染土壤（模擬土樣），并將其密封儲存在滅菌牛皮紙袋內冷藏備用。
LB培養基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂15g/L；菌種（包括根瘤菌（A）、節細菌（B）、嗜鹽菌（C）和芽孢桿菌（D））：實驗室保藏；表面活性劑：主要成分為槐糖脂。
PHS-3型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；
721型可見光分光光度計：北京光學儀器廠。
1.2實驗方法
1.2.14種單菌與土著微生物石油降解率的比較
采用LB培養基保藏4種單菌。將模擬土樣按每份50g分別裝入80個錐形瓶中，并將錐形瓶分成5組，每組16個。取其中4組分別以50.0mL/kg的接種量加入A，B，C，D菌懸液，置于28℃恒溫箱中。剩余1組未加菌種，作為對照樣考察土著微生物的修復作用。每間隔一段時間取樣，采用重量法測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率。
1.2.2優勢菌群的構建和最佳配比的確定
對4種菌進行2種、3種、4種的組合，分別將不同組合的混合菌按一定的接種量加入到模擬土樣中，每組加入的混合菌菌懸液的總接種量均為50.0mL/kg，各加入菌的接種量分別相等。在28℃的恒溫箱中放置40d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率，從而構建出優勢菌群。采用均勻設計法對優勢菌群的配比進行優化。
1.2.3培養條件優化實驗選取
5個影響石油降解率的代表性因素：混合菌接種量、土壤含水率、雞糞加入量、麥糠加入量和表面活性劑加入量，并將其控制在不同水平，采取均勻設計考察各因素對修復效果的影響。按確定的最佳配比將4種菌接種到石油污染土壤中，在28℃的恒溫箱中放置40d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率。
1.3分析方法
1.3.1土壤理化性質測定方法
采用電位法測定土樣pH，水與土的體積比為2.5；重鉻酸鉀容量法測定模擬土樣的有機質含量；半微量凱氏法測定模擬土樣的總氮含量；鉬銻抗比色法測定模擬土樣的總磷含量。
1.3.2土壤酶活性及微生物種群數量的測定
采用TTC法測定模擬土樣中脫氫酶的活性，奈氏比色法測定脲酶的活性，鄰苯三酚比色法測定多酚氧化酶的活性，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶的活性；采用菌落形成單位CFU計數測定土壤的微生物種群數量。
2、結果與討論
2.14種單菌與土著微生物對石油降解率的影響
4種單菌與土著微生物對石油降解率的影響見圖1。由圖可見：使用4種單菌時石油降解率的高低順序為D>C>A>B，且均高于土著微生物；D菌處理40d后，石油降解率達30.08%，而土著微生物處理40d培養后的石油降解率僅為5.02%。
2.2優勢菌群的構建和最佳配比的確定
混合菌的配比對石油降解率的影響見表1。由表1可見，當A，B，C，D4種菌混合使用時，石油降解率最高，達到40.02%。
采用U11（114）均勻設計表進行實驗，確定A，B，C，D4種菌的最佳配比。U11（114）均勻設計的實驗方案和結果見表2，其中：X1為A的質量分數，X2為B的質量分數，X3為C的質量分數，X4為D的質量分數。
U11（114）均勻實驗的數據處理采用UniformDesign2.10軟件，得出回歸方程見式（1）。
方差分析表中顯著性水平為0.009<0.01，回歸方程變量間關系是極顯著的。混合菌的最佳配比為：X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%，預測最高石油降解率為54.30%。在最佳配比條件下進行驗證實驗，石油降解率為54.50%，與預測結果的誤差為0.37%。實驗值與預測值的誤差在允許范圍之內，說明均勻設計優化的菌種配比準確可信。
2.3培養條件優化實驗
采用U14（148）均勻設計表進行實驗，研究各培養條件對石油降解率的影響。U14（148）均勻設計的實驗方案和結果見表3。其中：U1為混合菌接種量，U2為土壤含水率，U3為雞糞加入量，U4為麥糠加入量，U5為表面活性劑加入量。
U14（148）均勻實驗數據的處理采用UniformDesign2.10軟件，得出回歸方程見式（2）。
方差分析表中顯著性水平為0.001<0.01，回歸方程變量間關系是極顯著的。菌群的最優培養條件為：混合菌接種量122.0mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90g/kg、麥糠加入量150g/kg和表面活性劑加入量22mL/kg，預測最高石油降解率為67.35%。在最優培養條件下進行驗證實驗，石油降解率為66.95%，與預測結果的誤差為0.59%。實驗值與預測值的誤差在允許范圍之內，說明均勻設計優化的菌群培養條件準確可信。
2.4微生物修復前后土壤性質的對比
分別將未經處理的模擬土樣、經土著微生物通風堆肥法處理的模擬土樣、經混合菌處理（最佳配比及最優培養條件下）的模擬土樣記作M1，M2，M3，考察微生物修復前后土壤理化性質、酶活性和微生物種群數量的變化。經過不同處理的模擬土樣的性質見表4。
由表4可見，M3的修復效果最好，石油降解率達66.95%，而M2的石油降解率僅為5.02%。由于M3在修復過程中投入了大量的營養物質，因此土樣中有機質和總氮含量大幅提高；而M2的各指標變化則不如M3的明顯。M3中脫氫酶和過氧化氫酶活性最高，這是由于在修復過程中土壤微生物大量繁殖，微生物參與了石油烴的降解過程，使得脫氫酶和過氧化氫酶活性提高。M3中的脲酶活性最高，說明土壤的氮元素轉化能力強，有利于土壤中微生物的生長，為微生物參與石油烴的降解提供了充足的營養條件。而M2中各種酶活性的變化均不如M3中明顯。M3在細菌、放線菌和真菌的數量方面均明顯高于M1和M2，接近于自然界中實際的微生物數量。
3、結論
a）實驗室保藏的A，B，C，D4種高效石油降解菌均可提高微生物修復石油污染土壤的效果。單菌在40d修復過程中的修復效果遠遠超出土著微生物，且4種單菌石油降解率的高低順序為：D>C>A>B。
b）4種菌混合除油的效果最好，在最佳配比（X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%）條件下，40d后土壤的石油降解率達54.50%。
c）菌群的最優培養條件為：混合菌接種量122.0mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90g/kg、麥糠加入量150g/kg和表面活性劑加入量22mL/kg；在此條件下，40d后土壤的石油降解率達66.95%。
d）經混合菌修復的石油污染土壤，其肥力明顯升高，脫氫酶、過氧化酶和脲酶的活性均升高，微生物數量也有明顯增加。
